納米二氧化鈦(TiO2)是一種不易燃燒的無味白色粉末，以各種形式存在，如銳鈦礦型、金紅石型以及板鈦礦型。該材料具有高度穩(wěn)定、防腐蝕、高效光催化等特性，常被作為一種著色劑廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥以及涂料工業(yè)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來越多的納米粒子被釋放到環(huán)境中。其顆粒具有較大的比表面積，小尺寸效應(yīng)導(dǎo)致納米TiO2的生物毒性不同于常規(guī)粒子。近來，納米粒子對人類和環(huán)境的影響已經(jīng)引起科學(xué)研究者的關(guān)注。肝臟是機(jī)體主要的糖、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和激素等物質(zhì)的代謝器官，具有豐富的血液供應(yīng)和儲備以及獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還具有分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等重要功能。除此之外，肝臟在重金屬解毒過程中也起著非常重要的作用。納米TiO2對肝臟損傷的分子作用機(jī)制等問題尚未得到深入的研究。鑒于此，本文將分別以不同劑量連續(xù)腹腔注射兩周，以及連續(xù)灌胃30天、60天、90天兩種染毒方式研究納米TiO2對ICR小鼠肝臟的作用，探討引起肝臟炎癥的分子機(jī)制。通過本文的研究，可從分子水平上深入地了解納米材料的應(yīng)用對人體健康可能帶來的毒副作用，進(jìn)一步推動(dòng)納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。論文結(jié)果如下：1.對ICR小鼠進(jìn)行連續(xù)兩周腹腔注射納米TiO2（5nm，0，10，50，100，150mg/kg BW）和體相TiO2（150mg/kg BW），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.1在各器官中鈦的累積量由高到低的順序是肝>腎>脾>肺>腦>心臟（P <0.05），說明納米TiO2主要積累于肝臟、腎臟和脾臟中。各器官中鈦的積累與器體比的改變、器官的損傷密切相關(guān)。小鼠血清生化指標(biāo)異常：中高劑量納米TiO2(50,100,150mg/kg BW)處理后，肝堿性磷酸酶(ALP)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，亮氨酸氨基肽酶(LAP)，假性膽堿酯酶(PChE)，總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)六項(xiàng)指標(biāo)顯著高于對照組(P <0.05或P <0.01)；隨著納米TiO2處理劑量的增加，小鼠腎臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)肌酐(Cr)逐漸增加，血清Ca和血清P含量與對照比未達(dá)顯著差異(P>0.05)， UA和BUN隨處理劑量的增加逐漸下降；中高劑量處理組小鼠血清肌酸激酶(CK)，乳酸脫氫酶(LDH)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和-羥丁酸脫氫酶(HBDH)活性明顯增加(P <0.05或P <0.01)；總膽固醇(TCHO)、三酰甘油(TG)，葡萄糖(GLU)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度逐漸增加(P <0.05)，說明血糖及血脂代謝異常。1.2納米TiO2可造成小鼠肝臟病理性改變，通過病理切片可以觀察到炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹，空泡化，彌散性嗜酸性變，血管內(nèi)有淤血。通過透射電鏡可進(jìn)一步觀察到中高劑量處理組染色質(zhì)固縮、分布不均勻，線粒體腫脹、空泡化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體。1.3與同劑量微米級TiO2（10-15m）相比，納米TiO2（5nm）引發(fā)的肝臟炎癥更嚴(yán)重。出現(xiàn)的血清生化指標(biāo)改變、病理和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞因子表達(dá)的變化與對照組相比更明顯。1.4納米TiO2造成肝臟損傷的原因之一是體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的失衡。中高劑量納米TiO2處理后，ROS（如O2，H2O2）積累明顯加快，膜脂過氧化明顯加重(P <0.01)；超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT），抗壞血酸過氧化物酶（APx），谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性受到了顯著的抑制，還原型谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸水平、GSH/GSSG和AsAH/AsA比值隨處理劑量升高而降低（P <0.05或P <0.01）。由于抗氧化酶活性受到抑制，并減慢了抗氧化劑的氧化還原循環(huán)，肝臟對于ROS的清除能力下降，導(dǎo)致ROS大量積累，肝臟受到氧化脅迫而發(fā)生損傷。1.5納米TiO2不僅可以隨循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入動(dòng)物肝臟，還可以穿過核膜結(jié)合到肝DNA上。通過一系列的光譜檢測，發(fā)現(xiàn)Ti4+可以插入到DNA堿基對中，結(jié)合到核苷酸上造成DNA收縮而產(chǎn)生減色效應(yīng)，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變。納米TiO2可以與核酸中的O原子或者P原子結(jié)合，同時(shí)可以和DNA堿基對中的N原子配對，化學(xué)鍵長分別為1.87和2.38。納米TiO2與DNA的結(jié)合可改變遺傳信息的傳遞，在高劑量組還觀察到了DNA的斷裂。這些都可以造成肝臟的損傷。2對ICR小鼠進(jìn)行連續(xù)30天灌胃（0，62.5，125，250mg/kg BW納米TiO2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：納米顆粒可以通過血液循環(huán)到達(dá)各大主要臟器，由于全身血液均需流經(jīng)肝臟，導(dǎo)致肝臟所受影響最為明顯。隨著納米TiO2處理濃度的逐步增加，各實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中的下列指標(biāo)：白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板壓積（PCT）和網(wǎng)織紅細(xì)胞（Ret）逐漸減少，而紅細(xì)胞平均體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、血小板總數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞比積（HCT）、血小板平均體積（MPV）逐漸增加。250mg/kgBW納米TiO2處理組以上各參數(shù)與對照組相比均存在顯著性差異（P <0.05或P <0.01）。血液指標(biāo)的變化顯示，長時(shí)間接觸納米TiO2可能使小鼠因急性反應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)出血、骨髓造血功能低下，最終導(dǎo)致貧血。PLT、MPV的增加說明納米TiO2對小鼠凝血功能有影響。RBC、HGB的減少使血液攜氧量下降，可能降低小鼠的新陳代謝以及免疫反應(yīng)。自然殺傷細(xì)胞（NK）的百分比、T淋巴細(xì)胞各亞群（包括CD3、CD4、CD8）百分比、B淋巴細(xì)胞百分比下降，CD4+/CD8+比值下降；IL-2分泌減少，血清中IgM水平明顯下降，說明小鼠免疫功能受到了抑制。3對ICR小鼠進(jìn)行連續(xù)60天灌胃（0，5，10，50mg/kg BW納米TiO2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：納米TiO2可以活化肝臟kupffer細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞因子如TNF-α從而激活NF-κB信號通路。多個(gè)促炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，如：巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，C反應(yīng)蛋白(CRP)，白細(xì)胞介素-4(IL-4)，白細(xì)胞介素-10(IL-10)的基因和蛋白表達(dá)量。促炎-抑炎平衡被打破，引發(fā)炎癥級聯(lián)效應(yīng)。正是通過這樣的信號通路（如改變TLRs以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)）降低了免疫能力，造成肝臟損傷。4對ICR小鼠進(jìn)行連續(xù)90天灌胃（0，10mg/kg BW納米TiO2）后，以全基因表達(dá)譜為背景，對小鼠肝RNA進(jìn)行了微陣列分析測試，結(jié)果顯示：1035個(gè)基因發(fā)生顯著變化，其中745個(gè)基因涉及代謝過程、細(xì)胞通訊、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期、凋亡和轉(zhuǎn)運(yùn)等等關(guān)鍵生理過程。代謝過程中差異化表達(dá)基因最為集中，為394個(gè)，所占百分比為52.2%，其中254個(gè)基因上調(diào)，140個(gè)基因下調(diào)。脂質(zhì)代謝過程差異表達(dá)基因?yàn)?6個(gè)，涉及“生物氧化”，“膽固醇生物合成”，“內(nèi)源性固醇”，“脂類及脂蛋白代謝”等通路。免疫系統(tǒng)差異表達(dá)基因共98個(gè)，59個(gè)基因上調(diào)，39個(gè)基因下調(diào)。 Cfd是“固有免疫信號”通路差異表達(dá)的基因之一，它的顯著下調(diào)可使補(bǔ)體激活下降，固有免疫應(yīng)答下調(diào)。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因也出現(xiàn)差異表達(dá)，28個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)。上調(diào)的Axud1可以上調(diào)Axin的表達(dá)，從而激活凋亡相關(guān)的信號通路，開啟細(xì)胞凋亡的過程。綜上，肝臟是納米TiO2進(jìn)入小鼠機(jī)體后積累和損傷的主要器官，作用機(jī)制包括氧化脅迫，炎癥瀑布級聯(lián)效應(yīng)，DNA損傷，免疫功能異常和多基因共同作用等。